Overview

I am interested in designing primers for Botryllus schlosseri to evaluate differences in expression of apoptosis, stemness, oxidative stress, and senescence related genes after an acute 24 hour exposure to two concentrations of nickel chloride, 5 mg/mL and 45 mg/mL, and a control.

Potential Gene List

This list serves as a jumping off point for myself to look into genes that may potentially be differentially expressed in Botryllus schlosseri exposed to the clastogen (by oxidative damage to the DNA), nickel chloride.

Role	Gene ID	Whole Gene Name
Senescence	TP53 (p53)	Tumor protein p53
Senescence	CDKN1A (p21)	Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A
Senescence	CDKN2A (p16)	Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
Senescence	SIRT1	Sirtuin 1
Senescence	SIRT6	Sirtuin 6
Senescence	FOXO3	Forkhead box O3
Senescence	IGFBP3	Insulin-like growth factor-binding protein 3
Apoptosis	CASP3	Caspase 3
Apoptosis	CASP8	Caspase 8
Apoptosis	BCL2	B-cell lymphoma 2
Apoptosis	BAX	BCL2-associated X protein
Apoptosis	FAS	Fas cell surface death receptor (CD95)
Apoptosis	TNF	Tumor necrosis factor
Oxidative Stress	HSP70	Heat Shock Protein 70
Oxidative Stress	SOD	Superoxide Dismutase. Various isoforms, such as SOD1, SOD2, and SOD3
Oxidative Stress	CAT	Catalase enzyme
Oxidative Stress	HMOX1	Heme oxygenase enzyme 1
Oxidative Stress	NQO1	NADPH quinone dehydrogenase 1
stemness	MYC	Myc proto-oncogene protein
stemness	SOXB1	SRY-Box Transcription Factor B1
stemness	POU3	POU Class 3
aging and proliferation	HSPA9	Mortalin

Two Approaches for Acquiring Primers

Extensive search in the literature for pre-designed Botryllus specific primers.

For the purpose of expedience and accuracy. This generally is the preferred approach.

Gene	NCBI Accession Number	DOI	Fwd Primer	Rev Primer
Mortalin	KY212120	doi:10.1016/ j.ydbio.2017.10.023	TTCATGATACCGAA ACCAAGATGGACG	AATTTCCTCCTTG ATGGCATCCACC

Design primers in-house for Botryllus schlosseri.

Protocol

To design primers in-house for Botryllus schlosseri we will utilize the Botryllus Genome Project browser. Here we will use their BLAST tool to search for hits in query sequences as well as use their available sequecnced genome to extract those sequences which will allow us to design primers in IDT’s PrimerQuest.

Start with Gene of Interest: Identify your gene of interest. You might want to use annotated genes for more closely related species.

Go directly to NCBI select the database to be nucleotide, and paste in the following but replacing “GOI” with your gene of interest:

“((GOI[Botryllus schlosseri]) AND”chordates”[porgn:__txid7711]) AND “tunicates”[porgn:__txid7712]”

This will pull up any related gene sequences for your gene of interest for Botryllus schlosseri and any related tunicate species. You may use mRNA or protein sequences for your query, just be sure to select either blastn or tblastn, respectively.

Tip

Try to select sequences to blast that are shorter and more specific, ideally no more than 1,000 bp for sequences from a different organism. I noticed that sometimes if you blast a very long sequence from a different organism, you will get E-Values that look great but could be a potentially misleading conclusion. Longer sequences have more chances to match with a target sequence, so the E-value is less informative.

Try to select FASTA sequences from tunicates more closely related to Botryllus schlosseri. See diagram below for reference.

Figure 1: Genome Biol Evol, Volume 12, Issue 6, June 2020, Pages 948–964, https://doi.org/10.1093/gbe/evaa060

Retrieve Sequence: Access the gene’s sequence from NCBI Gene, by selecting the FASTA link. Copy the entire sequence starting at “>”.
Use Sequence in BLAST: Paste the sequence into the Botryllus Genome Project’s BLAST Tool to identify homologous sequences in the Botryllus genome.
Select Top Sequence: Identify the top sequence from the BLAST results, which has a significant alignment to your gene of interest. You will only want to pursue top hits that have an E-Value of ≤ 1e-10. Record the sequence ID, E-Value, and Score (bits).

Tip

Pay attention to the E value and Score (bits) to determine if your top hit sequence for the subject (Botryllus contig database) is significantly in alignment with the query. A commonly used threshold is E ≤ 0.001, which suggests that you would expect to see a similar match in a random database of the same size less than once by chance. For more stringent analyses where you want highly reliable matches, you can set a lower E-value threshold, such as E ≤ 1e-5 (0.00001) or even E ≤ 1e-10 (0.0000000001).

Retrieve Botryllus Sequence: You locate the matching sequence from the Botryllus genome by searching the “botznik-ctg.fa” file using the contig name you found.
Primer Design: Finally, we will use the extracted Botryllus sequence to design primers. We will design primers using IDT’s PrimerQuest Tool.

Note

We will be using SYBR Green for the qPCR we are conducting so when on PrimerQuest select qPCR Intercalating Dyes (Primers only)

This method allows us to leverage well-annotated gene data to find potential homologs in Botryllus schlosseri, even when the genome may not be fully annotated. We will want to validate the primers and ideally carry out experimental verification to confirm the presence and function of the genes in Botryllus schlosseri.

Sequences Identified with BLAST Tool in the botznik-ctg.fa Database

Role	Gene ID	Query NCBI GenBank Accession	Query Organism	Top Sequence Producing Significant Alignment	Score (bits)	E Value
Apoptosis	TNF	LR791346.1	[Phallusia mammillata]	botctg065850	70	1.00E-09
DNA Repair	PolB	LR789137.1	[Phallusia mammillata]	botctg092056	60	1.00E-06
Oxidative Stress	SOD1	XP_039262007.1	[Styela clava]	botctg006757	199	8.00E-51
Senescence, DNA Damage Repair	SIRT6	BAO57219.1	[Polyandrocarpa misakiensis]	botctg109566	446	e-124
Apoptosis	BAX	KU948200.1	[Botryllus schlosseri]	botctg061218	2260	0
Apoptosis	AIF1	KU948202	[Botryllus schlosseri]	botctg003666	674	0
Apoptosis	IAP7	KU948203.1	[Botryllus schlosseri]	botctg106479	1483	0
DNA repair	PARP1	KU948201.1	[Botryllus schlosseri]	botctg019995	1191	0
Stemness	MYC	OL828248.1	[Botryllus schlosseri]	botctg007779	2857	0
Stemness	SOXB1	OL828250.1	[Botryllus schlosseri]	botctg003503	1173	0
Stemness	POU3	OL828252.1	[Botryllus schlosseri]	botctg006949	1383	0

Pulling Botryllus schlosseri Sequences and Placing in New File

In order to access the sequences for the genes of interest (GOI) it will be easier for us to curl the botryllus contig sequences fasta file now available on the Botryllus Genome Project website. I selected this file as opposed to the complete transcripts file since upon initial investigation, I found that it was more complete than the transcripts file. Because the Botryllus schlosseri transcriptome is not well-annotated, the contig sequences file may allow me to identify potentially novel genes.

curl -o data/botznik-ctg.fa http://botryllus.stanford.edu/botryllusgenome/download/botznik-ctg.fa

Let’s take a peak at the file we just downloaded.

head -n 10 data/botznik-ctg.fa

>botctg000019
TGACTTGACTTGACTTGACTCGACTTGACTCGAGTCACCTCCAAAAAACGAGTGACTTGA
CTTGACTCGAGTCACCTTTGAAAATCGATTGACTTGACTTGAGTCGAGTCAAAATCTGCA
ATGACTCGAGATGACTCGTGACTCGAAGGTAGTGACTTGATCCCAACACTGGTAGAGAGT
ACCTGACAAGGAAACGATTCTGAATAGGATGAAATGAACATTCGAATCGCGTCGCGAGGC
CATTCTGAATGGGATGTCAACACAGTCTGCTGGAGATTTACCCGATCTTGATCGATGCGC
ATTGGGTACCGTAGGTATAAAGCAGTGTTATGATCAAGTCACAGACGGCACGTAAAACGA
CTTTGGTAAGGAAAGTGAGAGCTCCACAGACGCTGATGTGGGTTGCCACTTCTGCAGGTG
TGCATAAAGCGCTGGTGAAATGTCTTGTATTTGCAGCTCCATTATTTGATAAACCTCGTT
TTAGTCCAATCGCTTCTTAATGAACATTTTGAGCTTTATGACCTAACCAGGAAAATGTGA

Create an empty extracted_sequences.csv file. We will upload this csv file to PrimerQuest directly.


touch output/extracted_sequences.csv

Now let’s pull the sequence for the top hit contig. Below the code will check if the sequence identifier already exists in the extracted_sequenences.csv file prior to reprinting it into the file. ]

This will make us a csv file that we can upload to PrimerQuest directly.

# Define a mapping of identifiers to gene names
declare -A gene_map
gene_map[">botctg065850"]="TNF"
gene_map[">botctg092056"]="PolB"
gene_map[">botctg006757"]="SOD1"
gene_map[">botctg109566"]="SIRT6"
gene_map[">botctg061218"]="BAX"
gene_map[">botctg003666"]="AIF1"
gene_map[">botctg106479"]="IAP7"
gene_map[">botctg019995"]="PARP1"
gene_map[">botctg007779"]="MYC"
gene_map[">botctg003503"]="SOXB1"
gene_map[">botctg006949"]="POU3"

# Output CSV file
output_file="output/extracted_sequences.csv"

# Add column headers
echo "SequenceName,Sequence" > "$output_file"



# Loop through the identifiers
for identifier in "${!gene_map[@]}"; do
    gene_name="${gene_map[$identifier]}"
    # Extract the sequence and append it to the CSV file
    awk -v id="$identifier" -v gene="$gene_name" '$0 ~ id {flag=1; id_and_gene = gene; next} /^>/{if (flag) print id_and_gene "," seq; flag=0} flag {seq = seq $0}' data/botznik-ctg.fa >> "$output_file"
done

Let’s check out the extracted sequences in the csv file:

read.csv(file = "output/extracted_sequences.csv")

   SequenceName
1          PolB
2           MYC
3           BAX
4         SIRT6
5           TNF
6          AIF1
7          IAP7
8          POU3
9         SOXB1
10         SOD1
11        PARP1
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                  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TATTGTCCATTCTCGGTAATGTCCATTCTCGGTATTGTCCGTTCTCGGTAATGTCCACTCTCGGTAATAGCATTCTCGGTAATGTCCATCTCGGTAATAGCATTCTCGGTAATAGTAGGGAACCAGCTACTCGGCGTCTCAAAACTGTAGCCGCCAAACGCCATCTAGCGTCACCAGTTCAGCCGCCAAACGCCGTGTAGACATTCGGCCGCCGCGCGGCGTTTGGCGTCTGGCGTTTGGCCTCTGAGCGGGTTTAACCCCTGTTGATGATTTGGTTGACTACCATGTCACGTGGTGGCGTATTGTTTTGATTACTGCGGCTGCATTGAGTAACCGAAAACGTCCGCCTTTCACTATGTCTTGCGCAGCGTCGCTAACAAAGTAGCTCAATTCAAGGTGTTTTCTGCCGACGTTGCATAAGACATATTGTGGAAATAAGAAACTCGCAGTTGAGATCTGATTGTTCCATCGGTGAGATCGAATTTGTCGATTAGAATATATTGTGTCACGAAATTGAGAGGCAGATGAAATGATCAACCCTTCACCCACCCAATTCGCCATCGCCTACGGTGTTAGTGTTTTTCTGTCATTCTTTATTCTTATACCCGCAAGCATCGACTCGCACAATATGCGTGGAAATTGTTTGCTTACTGCAAAAGGTGAGAATAATGTAACCTGTGTGTTCGCTTTGTGCTTATGCTTTGAATATGGTTTTGATTCCTTTGAAACACGCTACGGTAATCCATGAGTACCAAGTTCGGTAGTATATGGCAGTGCGAAATCTTTTGGTGCTGTGTGTTGTGTCTTAATATTAACAAAGAACGTAATCCTATTTCTTTTTTGCAGGTTATTGGAATGAAACAAATGAACTGGTTGTGACATGGGGTCATCGATCAGCCTGCAATTTCATAGTGTTCATGGGTGTAGCATGCTTGCTATCCTCTCTATACTTCTTCTGGAACAGCATCTACTCTGTATGCAAGGGCTATGACGGGTAAGATGGGATGTACCGGTACTAAATCAGCTGACTAAAACTGAATGTAATTTCCATTAACAGCTCACCATTATTTTGTTTTGTTTCTCTTTTGCTGGGGGCATTTATGACAATTTCATTACTTTCTTCGTCGTTTATTGTTTCACTTGGTTACTCGTCTTGGTGTGACATTGTGACAGGAAAAAAAGATAATAGCCAAGTGTAAGTACATATTGCAAATATGATAGACTTGCATGCTATTTTAATGTAATGATGATGAATATGCAATTCTCAGGTGCTGGAAAGTTGACCTTGGAAATTTTAATAAAGAGTATCATGTGAACAGTGATGATTTTAGTTCAGACTTGGAAATTATTGAGGTATGTAATTTTATGACTTGTCTGGTAGATTCTCATATAGGCCAGTCTGCTTTTACTGGTTCCAACAGGCAACATTTACAGTATTTCCGTAATTTTGGTGGGTTGAAACTTATCCCTTGAATCCTTAAATCCCTTGAAAGAGCCTTCATGTTGACTATAAATTGTAACTTTTACATGACGTTAAATCGGACATGAAAGCTTTTTAATTTTGCTAGTGTGGGGGGTTGCCACAGCAGATCAGTGATTTGCATTGTGATCCGTCCTAAGCTGCACCCGTCCTTGGTGCCGGCTGGTACTAGTCTTGCTGACCATTGGTGTGTGAGACATCGAAGATATTTTGTCCCCATAATTCCTGTTGGTTGAACAAGGACTTGCCATGATCGGATTTTGCTTGTATTGTGTGTTGCTTGTCTAGCCATGCCGATACCATCTACATGACCAAGTTTCTACATCAATCAGCTTTGCTATTATCATCATATTATAATTTTTCAGTTTGGTTCATGGAGTTCTACTCTATCGTGGGTTGCCGCGACGGTCCTATCCTTCTTCAAAGTAAGATACTACCATAAAAATGAAGAACTCATTCAAGGACTGGCTTTGGAAAAGGATTCTCTCATTCCGTATCGGTTGCGTTATCAGAAAATCGACGAGGGTTCCTCATATACCTAATGTTGCATCCATCAATTCCTTATCCGTTCCTCTACTGCAGTTATTTTTGCCTCGCCATCAATATACACCGTGCTTACTGAGTATTATATACACACCTATACTACGTGGTTATTTCTGATATTATGTGGAGTATATCAATTAGCAGTTAATGGGAGTGGTTATATATGGATTCTAGAGAGCGCCTGTCATGATTCATCAGTGAGGTTGCAAGCTAGTTATGGCAGCGAATTTAAACTACCTGTCTAATGAGCTAATGGAGGGAATTTCGACCTCACCCTTACAAATGTTTGGCATGCTTGGGTTTATAGTCAAATTCGCTGCTATTAATCAACTCGTGGCTAGTAGACCATAATCCAGGGTTGTCACGACTCGTCTCGCAATTTTCTGATGACTGGAGTCATTTCCTCAAAATACGGAACAACTCGAGACTCAGATGGCCAAGATCGACATGTCATTGTAATTACGAAGAATAGTAAAAGTAACCACACTATTGCGATTTCATCTATTGGTACTGGAGAATGCTAAAAGTGTGGAAAATTAGTAGAATATAAATGTGAACCATTCGATATCACTCTACAGTGCAATCAACACGATGACTTGGACTCAACCTACTGCTCGCTGACTTGGACATAATACGGTGTTGAATTGAAAATGACTCGAGTCAAAACTATAACAGTGAAATTGGTTTGTGACTCGGAGCTGTGTGACTTGGTCACAACCCTGCCATGATTCTCCAGTTAACAATAGCAGCGAACTTGACCTGTCTAATGCTGATCTAATGGAGTGAATTTTGACCCCTTCCTTACAAAAAGTATGCAATATGGTCTGTTAGCCATGATTCTCCAGTTGGGGTAACTCGATCATACATCATGCAATAGCAGTATATTCACACAATGACTAAGATAACAGCGGTAACATGAAGGCAGTAACGCGAAAATGATCGCTGACACATGCTTACAATTGCGAATTCAGCAGTTTATTTACACGATGAGAAAAAGAAACAGCGGTAACATGAAGTCAAAAAGGCAGCAAAGCGAAAATGATGGTCAACAGATGCTTACTATTGCGAACTTGGCAATGAAATCACCACAACAGATAGCACAAAATGTCATCAGCACTACACTGCGTAATGCTTTTAGTAACAACCACAACAGATGATGGCACTTACCATTGACTTTGCATATTGAATTTAGTCTTCACTAAATATCTCAAGTTCACTTGCGCTACATCGTACACTATGTATTCATTGTAGAGTAACGACGTTCCTTCACAGCCAGACTCCTTCCCGGACCCTACATGGGCTATGGTGCCATCTTTCATCGTGTAGTCGCTCGATTCGTCCGGGCATGTGGACCCCATACCCTTGACGCTGTGCTTTCCTTTCGGTAGCTTCCGTACGTCCATGGCATTCTTCAACTCGCGCCTAAAAAAAGGTGGCACGTCGATATCACTGTACAAACAAGTGCACACTCAGTAATGAACTCACATATTTCCCAGCGCTACTTCAGCGAGCAATAACAGTCCGTATGGATTCCCATGCGACGCATGGCAGTAATTCGCACTTTTCGAAACCATATCGGCAAAGTACAACCCCTTGCCGAACATATATCCCGTCTGTAATGCAAGAGTCATAATTTTCCAATGCAGTAGCAGGTGAATATAGAGGTTTTTGCAAGCAATTTTTGAATGCAGGGAAGTGACGATAAAGCATTTTTCAAACTGGACCGTTCAGTGTTTGTGACAGGGTGACTAATAATGAAGTTTATACAGATTAACCTGTGCGGATCACCTCGATAAGATACACTCGCCATATCCAAGTTGTTTCGACCGCTTGCTATCTTTTTATTTTATCACAATTTTGTGGTACTGTCAATTGATAAATTCATCATTAAACTGAACGGAACCGACATGAAACCAGCGGGGTCAATCAAATGTGCAAAGGCCTCTTCCATAGGCTAATGCAAACATGGAATATGTTTATAAACCATTTCCAGCGGAGGACGCACCTTTGTTCTTGCATGGTCTCAGAACAAACGCCTGGGCGAGTTTTGGGTGGGAATGGGTGATTCAGTGCCCTAGATGTCAACAAGTGGATACTAAAATCAGGCAGAAAGAATCTATTTACATTAGCGCACATCAGGAACCAAAAGGCGATAAGTGCCGAAATTCGAGCGAACAACATTTCATGACGTACCACAGGCGCTTCGGGCGGCGCAATCCTCAAGCCCTGTGACAAAATGCCGGCGTAGTTGGTCACACGAGAGCCATGCCACAGCAAACGACGGTTGTGCAGCTTCTTGAACGGCCGGTAGCGGCTTTTTTCACCTTAAAAACTGACGAGGTCAGCCGTCGCCACGTCAGACGATTACGAGTTCATTCAGCCTACCTTTACGGTCCAACTCAAATATTTCTTCGACTTCGAGACTGTATGCGGAATGGGTCTTGGCGTGAGTGTTTTGCACCATGTCGCCGATCACGTTACGCATTTCGTCGTTGGCATCGAGTGGCTGCGGAGAAAAATTTATTTTCCGACCGTGAATACCAGAGGCGGTCAGTAACAAAGTGCTTCTACTTTTCATACCAAACTCCAGTGAAAACATGTATTTGATGTCTTCTACGCTACTTTCTTCCAAGTAGTTTTCTGTCTACTTGCAATAGTTGATCAAGTGGTTACGATTTTAAACTGCTACTTCTACCTAACAAAAAAGTTCTAGAATTACTAGAAAGTCGCTACTTCTATTTGTGCTCAAGTAGATGAGATAGTCAGTAAGGAAGTACTCGTCTTCAAGAGGTATTCAATACTTACTCAAGTGGTTTTAATTTTCAACTACTGCCACTCACCAGTTTCGAGTGTTAGGCAAAACTAGGCCTAGAATACTTTTACGTAATTGGAAACCGTTACTTCTACTTGCATTTGAGTATCAACAATGACTACTTTGACAACATCTGGTGAAAATGCTCCGGACAAGTTGGGAAACACGGAGAAAGCAAGGTAACCTCTATTCGGCATTGCAGTTTCTTGTACTGAGTGTCGATGGGGTCTTCCTCCTTTACGTTGGCGTAGTCGCCTTGGAGCAGATTGTACGCGACCTCTATATCCAGCAGGCTGTCGATCATCTCGACCTGTCGTGCAAATTCGGAGAATTAGAAAGAAAGAACATTGTATATAAAAATCGCATCACAGAATCCGACGATTGTTAATATAAAATGTTCTTTCCAATCCTCACTAATTGCTGACGATCAACCCATACGAGGGTTAGCCGAAAATACACGGATTCATTCCAATATGAACATACAATTCAAATGCAATTGCAGTTCTGTACCTTAAAGAAGCTCTTCAAATACTTATAATTCAGTAGAGATTTACAACGTTACTTATACTCGAATAGCAACAATGGTTACTTTAGACACCTCTGTTGAACACCGGCGATCACGGTTAGCTGTGTAGCAACACATGACGATAGTTCGGGGCCACTGATTATGACCTAAGCACAGCATTCCTTTATTATTCTCCACACAAACCACACCAACACGGACACCGTGTTATACGCAACAACAACGTTAAACATAACCAGTTATCTACCTTGGACTTGACCAACTCTATGTTGTTCAGCATCGGCGGCTGTTTCATTCCGAAGTCATGCGGGATCAAAGTGTAAAATCTGTTTGAGCAATCCAGTATTTTGGGAGCGCTTGGTGTTTCGCTTTCAATAATCTGAACGGGAAGACATACTATTATGAGAAGCATCCGCAGATTCTTATGAATGTGGGAAACATTCGCTTCAGTCTGTACATGATTTATATTTCTATGGATTCAAACTCCATATTCTTTGGTTAATCGTCGATCATCGAGACAAATTTTTGACATTTCAACAAAGCAGAAGTTTTGTATTAATACATCATGTTAAAATAGTTCTTTGAAGTGTTTTACCTAAAAATGCGTTCACAATCTTGTCATAACTCTAATTCTCAGTTCCTAAAGAGTAACATCCAGCACATCCTATATTGTTTCACAACACATTTGTACGGATAGAATTCGCTTGAAAGCGGAAATTCAAGTCACGAGCGACTAAACGTGGTTGTCTACAGCTAAAAGAGAATCAATCAATTGACCCAATGTAATGTTAACGATCGATGCGAGAGACATTGCAGAACAAAGCCCACTTACCCCGGTCACTTCGGACAGTACCCCGTACGCTCTCTGCAGCTGCTTCTTACTTAACTTACCGAGAGGCATCTTTTTCATATCCAGCTGCAAAACAAACGTTGCTAGGAGGACCGTAGCCCTTCAACGCAGAAGCGATAACGACCAGTCGCCAACCAACCTCGAATTCCACCATCGCCTTCTTCATGCTTTCCACGTCAAATATCATCTTGATGATCTTTTGCACTTCTTCATGTAGCTTCGAATTGCTACCGGCAGATTGCAAGCCCTTCAGCTTCTCATCGTTTTCACCGTAATCGATGTCGAGAGGATAAAATTTTCTGGGCATCTTCACGAAATGAGCGGTGCCAAATTCGTTGCCTGAAATGTCAGAAACATTGAAATGACCCCTGAATATTTCTCATATAGCTGGCATTAGGTAGACATACTTTTGAACTTAGTTCATGTCATGCGCGGATGCGATGAAAATTTGGTTTTAATTCGACACCACACATTAGCTCGCACATTGATATCTTCGTTGCTCACCAGTTTTATCTAAATAAATTTCTTCAAAATTTCTCAGTGCCGCATCAACGGAATAGAAGTCCTCGACTTTATCTCCCCCTATCGTCGTCCCAACTCGACCCCAGGCCCGGAACACATAATATTTCTTCTTCGAGTCATGCTCCAGAAGCTAGAGATTCGATAAGATGCGGGCACAAATTAACAAAACCTGTCACTTACAACAATACCAGAACGCGGTACCTGCAATTTATAATAGGAATTTGCGCCCGTATTCATGTCCACCAAGGATAGGGTTGCTGTGTACTTCGAGCCGTTCTTGACCTAAAACAATTGAGACATTCGAATCACGTAAAAGTGTTATGGCACAAGACACAAAAACATGTGAAAATATACAGCGGTGCAGGAATCAACACAATTTCATAGACAGTAATTATCTGACCAAGAAATATAATGAAATACAGGAAAGAAAATACCACGTTTTTGATAGAATACCGTATGTAAAACTTTTAAAAAATAACAACGCATAGGAGCAAAATAAACCAATTATACATAGAGGTAAACACATGAAACGAAGATAAGCTGAAAATTAGGTCCTGATAATACTTCGGCAGGGACACAAGTTCAATATTAGAGATTAAATTCAGAACAGAACCAACTGCTGAGTGTTGATATTTTAAAAATTTCGTCAAGACGCATCATAATATATCTGACTCCATCAACCGGCTTTCTCAGCAATGCATCACCGATCGAAACGAGGCTTACACACGGTCAAATTACATTAGCAAGTAGCAACTTAGGCGAAACACTCACCAGAACATGAGTTTTGTGCTCCAACCCAGACTGCTGATCAACTGCAGCGCCCGCTTTGACCACCATCTTCATTTTTTTCTCTGGCACGTTACCACTAACCTCCTCGAGAGCTCTTTTATAACCCAAGCCTCGATCCTGTTGCTCCGATCCCCAATCGCACACGCTGTGCTTTTTGAGCAAAGGCAACATCGGCTGTGGCTCCGACACGGCCTCGAGATCTTTCAAAATATCTTCAGAAACGACAAAAACATCTTGTAGCTGAGCCGAATGCATTTTTTTGCTCATTTTAGCAACTCCCTCCTTAGTGCTGATGCAAAAGTACGCCAGATGCACGGACGTAGTGATCGAACCGCCGAGCTTTTCGACAGACGCCTTGATGTCAGCCTTTGGTGAAAGCGTTTTTGTAAGAACGATAACCTTCATTTTTTTCAACGGCTTGAAAGGCGCTTTCGGCGGAAAAACGCGCTCCATTTTTTTATACTTATATTTCTCAAGAAACGGGTCTGATTCTCGGACGGATTTCGGGAACGACCAGGGTTGTCTCTCGACGACGGCCGTCCTATACGTGCACCGGGTCCATTCCGATATCTGTCCGGTGCATTTATATCCGTCGCTGCAGACCACCAGCGGTCCCGCTTTGCATTCCGGACACCAGGGCAAAGCCCCGAACGTCATGCCGTCACCGATGGCGAGATACAATGCGTCGTAGCCGATGGGTATTTTCTGATGATTTTCTTCCAGTATGCCTTCGAGAACGTCTTTGCGAAGTTCGATACTTTTGAGTCTGTCGATGTTCCTCCACATCAAGGTTGACTGCGATTTGATTTTTTTCATGATCAGGTCCTCTTCCGTTCGAACTGAAGGCAAATTCTACATAAGAACCGGTGCCTTGAATGATTTATACAGACGAAACAAATCTCTTTTGCCCAAGGAGTGCCCGAGTGGTTCTCAATCTTTTTCTACCCAAGGGCACCCTCTGAAAATGATGATAGTTTGCGCAGCCAAGCCATTCAGGACTATGAAAGCGAGATTTGTGAAGCTGATGACTAGGACATCAACCCATACCTAGATCACTTCACTGGTCAGCTGAAGATGTTGATGCTGGGCGACTAAAAAAGGTCATTCTCATTAATCATGGACTCATTGAGAATTGGAGATTTAGTCATCAGCTGCCAAAATGCTACTCATATGGATGTCCTTAATTTTTGTTAGCGCCTACTTGACAATGAATTTTACATAGAAGCTTTGCAAGTGCCATAAAACCAGTCCCACCAATTTCAGAAGCGGCTACTTTGACATAATGATATGCATATTATAGTGTGGCGACACATTGCAACATTTGACACGTTAGAGAAATGGACGTGTTAAGGCGATTGATGCAAATAAGGCATCATATTCAACGCGTTGTCACGTTAGAAGTGAAGAAAAGACGAAGAGCTACCCGACAACATCCACCAGTGGTACAGAATCTTACTTTCAGAAGTTGAAGGCTGTTCCGCAATCTTTTTTGCCTTTCCTTTAGGCTTCAGTAGTTTCCTCATCTGCGCTTTGTCGTCCGCGTCCAGCCCTTGGAACCCGGAGAGCATGTCCGCACTGAAGTGATCTTCCCAGCCCATTTCGGCCTTGTGTTTCAAGAAACATCCGACATGATGCCAACGATCAACAAGGCCGAGCTATCAAACAACACCAAATGCATATTAGACGGGTGAAATCATGGGAGGATGATGCGCCTTTGGCCCTGGGTCAGTGGTTTTCAACCTGTGGGTTGTCTGCCTTTTTTTTCTGGTGGTCGTGATCATGAAGGTACAGTCCTTTTTACATATGCAATAAGCTTCCAAAATAAGCCGTGAGCAGGTTAGGCGAGTAGCACACCAAATTTAGATTTCCAACTGGAAATTGGGCCGCAACCATAAAAAGGTTGGGAGCCACTGCCCTAGGGCTTTTCGACTGACGAAAAATGCGCCATCAACACACAAATCTTAAACGCTAAAATCGCTGAACACTTGAAAACATCGACATCAACAATAGGCTACCACTACCTCCCCAGCAGCACTTATTAGCTTAAAAATCAGCATGCAAGTGCTACCACCGCTGGTAGTAGCAATGCTCACCTGCGGCTTTTCGGGATGCTTCTCTTTGTGCGACAGCCGAATTTCGTCCTTCTCAATTTTATCCTCACATTGGCGGCATTTGCTCCTGTTAGACGCCGCGTATTGAACTACAAAGTCTCGCAGCGTCGTCGATATGATCTGACCGCAATGTTGGAAAAAATTGAGGAATTTGTAAGTCGGTGAAATTACTGTGGCAACATACAAGAAATCTATCAAATCAGGCGTATCACCGAATTCATAGTTAAATATAATTTAGCCTTGAATTTGCTTGGAGTTGCAATATCTGTATTGAAATTCAGAACATGAACAGTTAACTCAACCTTGCACCTACTTTCATCTTCACATGACTCTGAAAGTCTTTGCATATCTAGCAAATATCAACTGTAGTGAATCCCCCTCCTACCCCCAATCAATGGGGCAGTGACACAATGAATAATGCAAATAACCTGCCCTGCCCGGGCTTATAGAGCATCGTTACCTTTGTTCCACCTTTTGCAGACTTGGAACTATTTGCAAAGCCATCGATTTGCGTTCGAATTTTTTCTTGGTCTGGAAATCGGAGATTGTTGAAGCCCTTTATGTCATCGGAACAGGTAGGTCGATATTTTCGGAAGAAACAAGTGTAATGGTACCAATTTGGTTGCTGGAAATGAATAAAACATATTGGGTAAAAATTCTCAAGTATTGACTAGCCTATAAAGACAAAGAGGTCTATTTACTAGCTAATTTGAAAAATAACACTGAAACATATATACACAGTAAAGCGATGCGATCAATAACTAAATTAACGTAGTAGCTCACAAAATAGCCTACATTGTACAGGTATGCGGTTTCAATTCAAATTAGATTAAAAATGAACATTACAGGTACAGCTGCCAAGTATAAAATACCCACATACCTTGCCATCAAAAAATCGTGACTGTACCATGTAAGCAATTCTCAGACTTTCCTTGGCTATCAAGGCTTTGCAATCACGGCACATAGCCTTGTTACTCTTCGCATATTCTGCGACATAGTCATAATCATTACTACGCCCATCCATTTCGATCAAGTATCAATTTCAATTGCACCCAAGGAATCTATAGAAAATTCATTACAAGTTGCTATCCAAATCCAAACAAATGTACTGATAGAATATTTCTTATATTTAATAAAATTATTTCCAGACATATCGCAACCAATCATCAGCGGAAACCACATCGATGGATGAAAATTATTGCAAGTAAGAGTAATAGACTGCTATCATCGTAGCACGATTTTCATATAAACGGAAATAAAAAATGAGTCACCATGAACATGAAAATACAAAATGTGATAAATCTAGAATAGTAGGACTATTATAGGTAGTTTCTCGACTAAGATATAGCTGAATAAACTAGCACTGTCGTTTTAAGTCAACATAAATCACATCCATATCGATAAAAAAAAAGTCATCTATGAATTGCGCTGATGAGTAGCGCGTCTACATATTTTTCCAATTTCAAATATAAAATCATCCAGGATCGTTTTCCAAGGACCACTCAGATTCTAATATACTCATCTAATTATATACTCTAAGATAAAAGTAAATTAGGACATTTTTAGGTCCGACACGATGTCCAATTATCACTTTGAATATGTCCTATTAATACGGGTAAATTGCAATCATCAGCCGCGCCTATGTACCATTTTCAAAGTTCATTTAGCAATACCCCGGACAGTTTCCCGAGGACAAATATGGTTTTAATATACTCCAATGATCATAAACGTTGATATAAAAGTAAATTCAAACAATTCTA

Designing Primers with IDT PrimerQuest

General rules for designing good primers:

20 nucleotides in length, ideally
50% GC content, ideally
Tm’s of forward and reverse primers must be similar (2oC differences tolerated).
Primers cannot form stem-loops upon themselves.
No primer-dimers greater than 6 bp between each primer and itself and also between the two primers.
Forward and reverse primers should be about 500 bp apart.
The 3’ end of the primer should be a G or a C.

Confirmed Primers

Gene	Designer	NCBI Accession Number	Fwd Primer	Rev Primer
Mortalin	GJ	KY212120	TTCATGATACCGAA ACCAAGATGGACG	AATTTCCTCCTTG ATGGCATCCACC
HSP70	GJ	TBD	TBD	TBD